Fondato il 29 luglio 1545 dalla Repubblica Veneta per garantire agli studenti di medicina le necessarie competenze botaniche per la cura dei pazienti, fu ospitato in un area compresa fra la Basilica del Santo, quella di S. Giustina e il Prato della Valle, presa in affitto dai monaci benedettini probabilmente su suggerimento di Daniele Barbaro: è il più antico orto botanico del mondo. Arricchito di fontane e vasche tra il XVII e il XVIII sec., era dotato -oltre alla casa del Prefetto e del custode- di una Spezieria e di una Biblioteca, fondata nel 1835 grazie alla donazione di Giuseppe Antonio Bonato,  che fra i suoi volumi aveva conservato anche la biblioteca di Giovanni Marsili; fra il 1925 e il 1926 il Prefetto Giuseppe Gola decise uno svecchiamento delle raccolte conservando solo la parte strettamente botanica, mentre i volumi a carattere storico-letterario e di varia umanità furono donati alla Biblioteca Universitaria di Padova, dove ora costituiscono il Fondo Orto Botanico, e altri furono trasferiti nelle biblioteche di Farmacologia, Zoologia e Geoscienze dell'Università di Padova. Cfr. I Musei, le collezioni scientifiche e le sezioni antiche delle Biblioteche, a cura di C. Gregolin, Padova 1996, pp.141-167 e relativa bibliografia. C. Lestani, Il fondo Marsili nella Biblioteca Universitaria di Padova, Milano 2020.